Окрашивание многоцветное: Многоцветное окрашивание волос от 1800 руб. в салонах «Kawaicat»

Многоцветное окрашивание волос от 1800 руб. в салонах «Kawaicat»

Популярность окрашивания волос в несколько ярких оттенков сейчас растет во всем мире. Она обусловлена не только веяниями моды. Такой прием гарантирует образу неординарность, владелице многоцветной, радужной прически гарантируется повышенное внимание. Выполнить качественно это сложное окрашивание могут только опытные профессионалы.

Частый запрос в нашем салоне это радужное окрашивание, то есть 7-ми цветное окрашивание, но бывают и 2х и 12 цветные — мы делаем любые возможные варианты цветов и их переходы. Стоимость при этом насчитывается как окрашивание в 1 тон +20% если использовано 2-5 цветов и +40% если использовано 6 и более цветов. Стоимость берется за объем работ по окрашиванию и отдельно считаются расходные материалы по граммам — то есть мы не считаем Вам сразу 2-12 разных тюбиков красителя — мы считаем лишь те граммы, которые ушли!!! Для многоцветных окрашиваний это огромная экономия!

Пастельное окрашивание волос с растяжкой цвета

Окрашивание сплеш лайтс

Цветное окрашивание Санкт-Петербург

Вид цветного окрашивание на прямых волосах и в укладке

Радужное окрашивание

Многоцветное окрашивание на длинные волосы

Желтые волосы с растяжкой цвета

Довольные клиенты Kawaicat

Нежное пастельное окрашивание

Цветное окрашивание на очень длинные волосы

Потайное окрашивание

Яркое окрашивание глитч

Яркое солнечное окрашивание на красителе Антоцианин

Цветное окрашивание и стрижка боб

зеленые волосы

креативное яркое окрашивание

пастельное цветное окрашивание

мелкий глитч сложное окрашивание волос

серые волосы и цветные пряди

двухцветное окрашивание

трафаретное окрашивание

окрашивание на красителе Антоцианин самое стойкое

омбре на красителе Антоцианин

цветное окрашивание glitch

окрашивание не от корней

цветное мелирование

цветные пряди

окрашивание красителем Антоцианин

переход цвета растяжка

радужное окрашивание москва

рисунок на волосах

разноцветное окрашивание Санкт-Петербург

цветной шатуш

Цветные ультракороткие волосы выбривание

Окрашивание глитч

Многоцветное окрашивание

радужное окрашивание

Фиолетовые волосы

Желтые волосы Антоцианин

Цветное мелирование волос

Цветное окрашивание на коротких волосах

Красные волосы

Креативное окрашивание волос и стрижка

цветное мелирование

окрашивание волос в несколько цветов

омбре волос с белыми кончиками

фиолетовые волосы

Окрашивание с цветными кончиками волос

Зеленые длинные волосы.

Красное омбре. Красные волосы

Цветное окрашивание москва

Яркое омбре на антоцианине. Оранжевые волосы

Стойкое яркое окрашивание в красный цвет волос

Пастельный оттенок

Ровное длинное полотно цвета — очень сложная работа

Цветное окрашивание

В этом видео мы делаем волосы нашей любимой модели, доверяющей свои волосы Kawaicat и красителю Антоцианин. Вместе мы уже попробовали практически все варианты цветов и оттенков — благо Антоцианин не портит волосы и позволяет при смывке менять цвет!

Цветное биоламинирование

Пиксельное окрашивание

Цветное биоламинирование

Цветное биоламинирование

Цветное биоламинирование

Цветное окрашивание и сверхдлинные волосы

цветное окрашивание от стилистов с мировым именем теперь не проблема!

Цветное окрашивание

Видео процесса яркого окрашивания Антоцианином

Цветное биоламинирование и стрижка с хаир тату

Цветное скрытое окрашивание

Цветное биоламинирование и укладка

Пастельное биоламинирование коллекция «точь в точь»

Цветное биоламинирование и укладка

Яркое окрашивание с осветлением антоцианин anthocyanin Kawaicat Кавайкэт

Цветное мелирование волос в 3 цвета. Антоцианин фиолетовый

Яркое окрашивание в антоцианин фото

Яркое окрашивание и стрижка

Пастельное биоламинирование коллекция «точь в точь»

Цветное биоламинирование

Цветное биоламинирование

Окрашивание в пастельные цвета. Красный антоцианин

Цветное биоламинирование омбре

Розовый антоцианин фото

Окрашивание волос в серый цвет — мы делаем все, кроме того, что вредит волосам =)

Стойкое окрашивание волос антоцианин фиолетовый

Яркое окрашивание в фиолетовый crazy color Kawaicat кавайкэт

Яркое окрашивание в розовый маник паник

бирюзовые волосы фото

волосы фиолетовые пастельного цвета

Яркое окрашивание зеленый crazy color

Цветное окрашивание в несколько цветов на очень длинные волосы. Kawaicat

Яркое окрашивание антоцианин

до и после окрашивания

яркое окрашивание волос цветными спреями/лаками

Яркое окрашивание ражий красный

Яркое окрашивание в голубой синий до и посл фото

Яркое окрашивание фиолетовые волосы до и после фото Kawaicat кавайкэт

Яркое окрашивание

Яркое окрашивание на мужчине

Яркое окрашивание и стрижка

Окрашивание челки в красный

Красивое многоцветное окрашивание может выполняться в различных техниках. Радужные оттенки могут располагаться от середины или от корней горизонтальными полосами. Яркие цвета могут украшать отдельные пряди или участки. Выполняется скрытое окрашивание, которое в офисе можно спрятать, а в ночной жизни, на вечеринке продемонстрировать во всей красе. Нет ограничений по выбору тонов и их количеству.

Лишь на первый взгляд создание эксклюзивной многоцветной прически может показаться несложной процедурой. Необходимы профессионализм и опыт для получения должного результата окрашивания. Обращение в наш салон поможет вам сменить имидж грамотно, добиться желаемого эффекта. Гарантиями являются:

Наши мастера обладают большим практическим опытом, отменным вкусом. Для каждой леди они найдут лучший вариант модной многоцветной прически. Красители нам поставляют известные мировые бренды. Популярность продукции является подтверждением ее качества.

3.6.3. Трудовая функция \ КонсультантПлюс

  • Главная
  • Документы
  • 3.6.3. Трудовая функция

Документ утратил силу или отменен. Подробнее см. Справку

Приказ Минтруда России от 09.10.2018 N 627н
«Об утверждении профессионального стандарта «Маляр судовой»
(Зарегистрировано в Минюсте России 31.10.2018 N 52576)

3.6.3. Трудовая функция

Наименование

Выполнение работ по окраске поверхностей судов, плавучих сооружений и их составных частей лакокрасочными материалами, обеспечивающими толстостенное покрытие, материалами ледового класса

Код

F/03.4

Уровень (подуровень) квалификации

4

Происхождение трудовой функции

Оригинал

X

Заимствовано из оригинала

Код оригинала

Регистрационный номер профессионального стандарта

Трудовые действия

Нанесение от руки с тенями и штриховкой в пять-шесть тонов букв, цифр, эмблем, звезд, знаков регистра, диаграмм

Грунтование и окрашивание металлических изделий (шкафов, ящиков, столов, стеллажей) установкой безвоздушного распыления

Окрашивание после грунтования поверхностей корпусных конструкций методом горячего безвоздушного распыления на установках в соответствии с требованиями международных стандартов

Окрашивание деталей лакокрасочными материалами, обеспечивающими толстостенное покрытие

Нанесение толстослойных покрытий на конструкции судовые

Грунтование поверхностей корпусных конструкций эпоксидными лакокрасочными материалами и лакокрасочными материалами ледового класса специализированными установками

Многослойное и многоцветное окрашивание, лакирование, шлифование и полирование выставочных экспонатов машин, аппаратов и приборов

Нанесение необрастающих термопластических красок аппаратами

Защита необрастающих красок консервирующими красками по специальной схеме

Рельефное, фактурное и экспериментальное окрашивание и аэрографическая отделка изделий и поверхностей при внедрении новых красящих веществ и синтетических материалов

Грунтование и окрашивание балласта полиурейной установкой

Необходимые умения

Применять установки горячего безвоздушного распыления при окрашивании поверхностей корпусных конструкций и металлических изделий после грунтования

Выполнять нанесение толстослойных покрытий на судовые конструкции

Производить грунтование поверхностей корпусных конструкций эпоксидными лакокрасочными материалами и лакокрасочными материалами ледового класса специализированными установками

Выполнять многослойное и многоцветное окрашивание со шлифовкой промежуточных слоев и с последующей полировкой последнего покрытия выставочных экспонатов машин, аппаратов и приборов

Выполнять рельефное и фактурное окрашивание

Выполнять экспериментальное окрашивание изделий и поверхностей при внедрении новых красящих веществ и синтетических материалов

Грунтовать и окрашивать поверхности внутри замкнутых объемов и помещений, внутренние объемы цистерн методом горячего безвоздушного распыления различными установками

Применять аппараты и установки безвоздушного распыления при нанесении необрастающих термопластических красок

Выполнять защиту необрастающих красок консервирующими красками по специальной схеме

Применять полиурейные установки при грунтовании и окрашивании балласта

Необходимые знания

Устройство и способы наладки установок для горячего безвоздушного распыления лакокрасочных материалов и аппаратов для нанесения термопластических красок

Технологии нанесения толстослойных покрытий на судовые конструкции

Виды лакокрасочных материалов, обеспечивающих толстостенное покрытие

Характеристики и правила эксплуатации специализированных установок для нанесения на поверхности корпусных конструкций эпоксидных лакокрасочных материалов и лакокрасочных материалов ледового класса

Правила и последовательность обработки поверхностей выставочных экспонатов машин, аппаратов и приборов

Способы выполнения экспериментальной окраски и отделки изделий и поверхностей, требования, предъявляемые к ним

Способы рельефной и фактурной окраски и аэрографической отделки изделий и поверхностей

Методы экспериментального окрашивания изделий и поверхностей при внедрении новых красящих веществ и синтетических материалов

Процессы нанесения необрастающих термопластических красок аппаратами

Схемы защиты необрастающих красок консервирующими красками

Принципы работы и правила эксплуатации полиурейных установок

Технологии окраски поверхностей полиурейными установками

Другие характеристики

3. 6.2. Трудовая функция
3.6.4. Трудовая функция

Руководство по многоцветному окрашиванию

Руководство по многоцветному окрашиванию

США

Благодаря широкому выбору антител, флуорофоров и инструментов, доступных для многоцветной проточной цитометрии, оптимизация многоцветных экспериментов может сбивать с толку и разочаровывать. Используйте наше руководство по многоцветному окрашиванию, чтобы помочь вам в разработке и оптимизации ваших экспериментов по проточной цитометрии. Освойте пять аспектов Руководства по окрашиванию, и вы будете на пути к легендарным открытиям. Когда вы будете готовы к поиску антител, перейдите к селектору многоцветной панели.

  • Яркость флуорофора
  • Ваш инструмент
  • Вебинары
  • Экспрессия общих маркеров
  • Правила
  • Другие источники

Яркость флуорофора

Ваш инструмент

Вебинары

Экспрессия общих маркеров

Правила

Другие источники

Важно понимать свойства и возможности каждого флуорофора, который вы можете использовать для многоцветной проточной цитометрии. Одним из таких важных свойств является относительная яркость флуорофора при конъюгации с антителами. Мы предоставляем эти значения с точки зрения индекса относительной яркости. Значения индекса яркости не являются абсолютными и могут варьироваться в зависимости от антитела, антигена, прибора и его конфигурации, протокола окрашивания, типа клеток и других факторов. Индекс яркости предоставляется в качестве общего руководства, помогающего в построении многоцветных панелей, где 1 соответствует самому тусклому, а 5 — самому яркому. В приведенных ниже таблицах также представлены спектры излучения и важные комментарии по использованию каждого флуорофора. Исследуйте флуорофоры с помощью лазерного возбуждения на вкладках ниже. Также используйте наш анализатор спектра флуоресценции или анализатор спектра полярного сияния для сравнения и анализа данных возбуждения и эмиссии. Узнайте больше о тандемных красителях BioLegend.

  • Ультрафиолет 355 нм
  • Фиолетовый 405 нм
  • Синий 488 нм
  • Желто-зеленый 561 нм
  • Красный 633 нм

Ультрафиолет 355 нм

Фиолетовый 405 нм

Синий 488 нм

Желто-зеленый 561 нм

Красный 633 нм

Ознакомьтесь с нашим полным индексом яркости


 

Наша служба технической поддержки готова помочь с любыми вопросами, которые могут у вас возникнуть в отношении многоцветной проточной цитометрии.

Техническая служба
Бесплатный телефон (США и Канада) 1-877-273-3103
Телефон (международный): 1-858-768-5801 
Электронная почта: Нажмите здесь

. Чтобы просмотреть полный список товарных знаков и патентов, упомянутых на этой странице, нажмите здесь.

PE/Fire™ 780 является фторсодержащим эквивалентом PE/Cyanine7. Он ограничен только использованием ASR и доступен только для клиентов из США.

Перед проведением каких-либо экспериментов по проточной цитометрии важно знать возможности вашего прибора. Вам нужно будет точно определить, какие флуорофоры вы можете или не можете использовать на доступных проточных цитометрах. Чтобы найти дополнительную информацию, воспользуйтесь нашим Руководством по приборам/Инструментом выбора флуорофора, ссылками на который приведена ниже, ознакомьтесь с руководством по эксплуатации вашего цитометра или обратитесь в местное учреждение Flow Core. Нажмите на изображение ниже, чтобы использовать руководство по приборам/инструмент выбора флуорофора.

 


Наша служба технической поддержки готова помочь с любыми вопросами, которые могут у вас возникнуть в отношении многоцветной проточной цитометрии.

Техническая служба
Бесплатный телефон (США и Канада) 1-877-273-3103
Телефон (международный): 1-858-768-5801 
Электронная почта: Нажмите здесь

. Чтобы просмотреть полный список товарных знаков и патентов, упомянутых на этой странице, нажмите здесь.

PE/Fire™ 780 является фторсодержащим эквивалентом PE/Cyanine7. Он ограничен только использованием ASR и доступен только для клиентов из США.

Многоцветная проточная цитометрия: флуорофоры Brilliant Violet ™ — «Multicolor Qi»

Модуляция in vivo Т -клеточная активация: 15 цветовой иммунофенотипирование, анализ цитокинов и энтибиторский перераспределение

40004. и экспрессия рецептора хемокинов человека


Наша служба технической поддержки готова помочь с любыми вопросами, которые могут у вас возникнуть в отношении многоцветной проточной цитометрии.

Техническая служба
Бесплатный телефон (США и Канада) 1-877-273-3103
Телефон (международный): 1-858-768-5801 
Электронная почта: Нажмите здесь

. Чтобы просмотреть полный список товарных знаков и патентов, упомянутых на этой странице, нажмите здесь.

PE/Fire™ 780 является фторсодержащим эквивалентом PE/Cyanine7. Он ограничен только использованием ASR и доступен только для клиентов из США.

Знание относительной экспрессии антигенных маркеров может помочь вам оптимизировать выбор флуорофоров в многоцветной проточной цитометрии. Как правило, для антигенов со слабой экспрессией выбирайте яркие флуорофоры, а для антигенов с высокой экспрессией выбирайте более тусклые флуорофоры. Эта стратегия обеспечивает более управляемую компенсацию для ваших образцов и дает вам наиболее точные данные для слабо выраженных антигенов.

Просмотр экспрессии общих поверхностных молекул на клетках крови


Наша команда технической поддержки готова помочь вам с любыми вопросами, которые могут у вас возникнуть в отношении многоцветной проточной цитометрии.

Техническая служба
Бесплатный телефон (США и Канада) 1-877-273-3103
Телефон (международный): 1-858-768-5801 
Электронная почта: Нажмите здесь

. Чтобы просмотреть полный список товарных знаков и патентов, упомянутых на этой странице, нажмите здесь.

PE/Fire™ 780 является фторсодержащим эквивалентом PE/Cyanine7. Он ограничен только использованием ASR и доступен только для клиентов из США.

При настройке многоцветной панели необходимо соблюдать несколько основных правил. Следуйте этим правилам, чтобы упорядочить и оптимизировать свои результаты.

  1. Выберите самый яркий флуорофор для наименее экспрессируемого белка и самый тусклый флуорофор для наиболее экспрессируемого белка. Чтобы помочь вам, мы составили таблицу, показывающую экспрессию общих поверхностных молекул на клетках крови. Как правило, такие молекулы, как CD45, CD3, CD4 и CD8, довольно сильно экспрессируются на своих типах клеток-мишеней и могут весьма успешно использоваться с тусклыми флуорофорами.
  2. Выберите флуорофоры с излучением, имеющим наименьшее спектральное перекрытие. Например, хотя спектры излучения Brilliant Violet 421™ и Pacific Blue™ не совпадают, они имеют значительное перекрытие, поэтому обычно следует избегать их совместного использования. Используйте наш Spectra Analyzer для просмотра и сравнения спектров возбуждения и излучения, просмотра лазерных линий и добавления пользовательских полосовых фильтров.
  3. Используйте тандемы (PE/Cyanine5, PE/Cyanine7, APC/Cyanine7) с осторожностью, поскольку они более подвержены деградации под воздействием света или фиксации. Они необходимы для больших многоцветных панелей, поэтому используйте их с осторожностью, чтобы предотвратить воздействие света, и используйте соответствующие буферы и протоколы фиксации.
  4. Избегайте кислых буферных условий с образцами, помеченными FITC, поскольку FITC чувствителен к низкому pH.
  5. Избегайте подвергать окрашенные образцы воздействию яркого света, так как большинство флуорофоров восприимчивы к фотообесцвечиванию, что приводит к потере их флуоресценции. Особенно это касается тандемных красителей.
  6. Избегайте инкубации клеток в фиксаторе в течение длительного периода времени, так как это может повлиять на флуоресценцию, особенно тандемных красителей.

Наша служба технической поддержки готова помочь с любыми вопросами, которые могут у вас возникнуть в отношении многоцветной проточной цитометрии.

Техническая служба
Бесплатный телефон (США и Канада) 1-877-273-3103
Телефон (международный): 1-858-768-5801 
Электронная почта: Нажмите здесь

. Чтобы просмотреть полный список товарных знаков и патентов, упомянутых на этой странице, нажмите здесь.

PE/Fire™ 780 является фторсодержащим эквивалентом PE/Cyanine7. Он ограничен только использованием ASR и доступен только для клиентов из США.

 

Анализатор спектров флуоресценции BioLegend полезен для анализа спектров возбуждения и испускания широко используемых флуорохромов для проточной цитометрии. Вы также можете создавать собственные полосовые фильтры, экспортировать изображения и добавлять настройки в закладки. В отличие от других инструментов спектров флуоресценции в Интернете, этот анализатор не использует Java, что позволяет ему хорошо работать на iPhone и iPad и просматривать его в стандартном веб-браузере.

 


 Селектор многоцветных панелей

 

Селектор многоцветных панелей BioLegend – это многофункциональный инструмент, разработанный для того, чтобы помочь вам найти нужные продукты для экспериментов с многоцветной проточной цитометрией. В ролях:

  • Простой интерфейс для панельной конструкции
  • Превью продуктов, включая данные
  • Предварительный просмотр спектров излучения и примечания к флуорофорам
  • Индекс яркости флуорофора
  • Добавьте элементы панели прямо в корзину
  • Контроль изотипа

Инструмент также предоставляет советы и рекомендации по созданию оптимизированных многоцветных панелей.

 


Архив Purdue

 

Архив электронной почты лаборатории цитометрии Университета Purdue Найдите в архиве электронной почты вопросы и обсуждения или задайте свой вопрос сообществу проточной цитометрии.

Архив цитометрии Purdue


 

Организации США

Медицинский колледж Альберта Эйнштейна

Медицинский колледж Карвера Университета Айовы

Международная ассоциация проточной цитометрии Великих озер

Международный центр аналитической цитологии

Лос -Аламос Национальная лаборатория

Национальная проточная цитометрия

Группа пользователей цитометрии в Новой Англии

Университет Университета Университета Университета Цитометрии. Центральная лаборатория

Вашингтонский университет Департамент иммунологии

Медицинский колледж Бэйлора Центр цитометрии и сортировки клеток

Общество клинической цитометрии

Онкологический центр Инграма – Университет Вандербильта

Лаборатория проточной цитометрии Дженис В. Джорджи – Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе

Национальный институт артрита, заболеваний опорно-двигательного аппарата и кожи Floweller University Rockefeller

3 900 Ресурсный центр цитометрии

Калифорнийский университет в Беркли, Центр проточной цитометрии

Чикагский университет, Центр проточной цитометрии

Институт рака Питтсбургского университета, Центр проточной цитометрии

Association Francaise de Cytometrie

Центр проточной цитометрии в Праге

Немецкое общество проточной цитометрии

Японское общество цитометрии

Шведское общество проточной цитометрии

Университет Калгари Центр проточной цитометрии

Датское общество проточной цитометрии

Молекулярная медицина, Ирландия

Химический инженерный факультет Бирмингемского университета

Институт Уолтера и Элизы Холл, Австралия


Литература

 

Книги

  1. Darzynkiewicz Z,Roederer M,Tanke H,eds. Цитометрия. 4-е изд. Бостон: Elesevier Academic Press; 2004. ISBN: 0125641702.
  2. Darzynkiewicz Z. Проточная цитометрия. 2-е изд. Сан-Диего, Калифорния: Academic Press; 1994. ISBN: 0125641427.
  3. Darzynkiewicz Z,Chrissman HA,Robinson JP,eds. Методы клеточной биологии: цитометрия. 3-е изд. Сан-Диего, Калифорния: Academic Press; 200; 63 (PT.A).
  4. Givan AL. Проточная цитометрия: основные принципы. Нью-Йорк, 2-е изд. Нью-Йорк: Уайли-Лисс; 2001. ISBN0471382248.
  5. Гроган В.М., Коллинз Дж.М. Руководство по методам проточной цитометрии. Нью-Йорк, Нью-Йорк: Марсель Деккер; 19890. ISBN 0824783301.
  6. Нгуен Д.Т., Даймонд Л.В., Брайлан Р.С. Проточная цитометрия в гематопатологии: визуальный подход к анализу и интерпретации данных. Тотова, Нью-Джерси: Human Press; 2002. ISBN 1588292126.
  7. Нуньес Р. Проточная цитометрия для ученых-исследователей: принципы и приложения. Норвич, Великобритания; Научная пресса Горизонта; 2001. ISBN 1898486263.
  8. Райли Р. С. Клинические применения проточной цитометрии. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Игаку-Сёин; 1993. ISBN 0896402002.
  9. Шапиро Х. Практическая проточная цитометрия. 4-е изд. Нью-Йорк, Нью-Йорк: Алан Р. Лисс; 2003. ISBN 0471411256.
  10. Уотсон СП. Введение в проточную цитометрию. Нью-Йорк, Нью-Йорк: Издательство Кембриджского университета; 1991. ISBN 0521380618.

Периодические издания

  1. Цитометрия Часть B: Клиническая цитометрия
  2. Текущие протоколы цитометрии
  3. Текущие протоколы в иммунологии
  4. Цитометрия Часть A
  5. Журнал иммуноанализа и иммунохимии

Наша служба технической поддержки готова помочь с любыми вопросами, которые могут у вас возникнуть в отношении многоцветной проточной цитометрии.

Техническая служба
Бесплатный телефон (США и Канада) 1-877-273-3103
Телефон (международный): 1-858-768-5801 
Электронная почта: Нажмите здесь

. Чтобы просмотреть полный список товарных знаков и патентов, упомянутых на этой странице, нажмите здесь.

PE/Fire™ 780 является фторсодержащим эквивалентом PE/Cyanine7. Он ограничен только использованием ASR и доступен только для клиентов из США.

ПродуктыЗдесь

    • Товары
    • Карьера
    • Заказ Вопросы
    • Свяжитесь с нами
    • Веб-инструменты
    • Литература
    • Индивидуальные продукты/услуги
    • Акции
    • Блог
    • Качественный
    • Техническая поддержка
    • Ресурсы поддержки
    • Заказ Вопросы
    • Найти дистрибьютора
    • Обратная связь
    • Компания
    • Политика конфиденциальности
    • Условия
    • Настройки файлов cookie
    • Налоговые формы
    • Торговые марки и патенты

Протокол многоцветного иммунофлуоресцентного окрашивания: Novus Biologicals

Двойное или многоцветное иммуноцитохимическое/иммунофлуоресцентное (ICC/IF) окрашивание полезно для изучения распределения двух (или более) разных антигенов в одном и том же образце клеток. Многоцветный ICC/IF можно проводить либо одновременно с использованием коктейля антител, либо последовательно, зондируя один антиген за другим. Одновременное и последовательное окрашивание следуют одному и тому же основному протоколу, но существуют значительные различия в этапах блокирования и инкубации антител. Во всех протоколах многоцветного окрашивания выбор непосредственно меченых первичных или вторичных антител очень важен. При выборе цвета флуорохрома для меченых антител необходимо учитывать спектр их флуоресцентного излучения. Эффекты просачивания будут минимальными, если выбранные флуорохромы имеют незначительное спектральное перекрытие. Кроме того, рекомендуется использовать самый тусклый флуорохром для маркировки наиболее распространенного белка и наоборот. Всегда следует включать отрицательный контроль, в котором отсутствуют первичные антитела, для проверки специфичности окрашивания. Эти меры предосторожности и советы, обсуждаемые в приведенных ниже протоколах, помогут эффективно/точно обнаружить несколько белков при иммунофлуоресцентном окрашивании.

КУЛЬТУРА КЛЕТОК

  1. Покройте покровные поли-L-лизином, высушите и стерилизуйте их.
  2. Совет. Покровные стекла можно стерилизовать, погрузив их в этанол и прокалив их пламенем, или поместив их в чашки для культур тканей и подвергнув их воздействию УФ-излучения (имеется в большинстве боксов для культур тканей).

  3. Посейте клетки на стерильные покровные стекла (покрытые поли-L-лизином). Некоторым типам клеток может потребоваться рост на других обработанных покровных стеклах для надлежащей адгезии. Расти клетки до полуслияния.

    Советы: В одну чашку можно засевать несколько покровных стекол, что помогает сократить количество чашек в инкубаторе. Сведите все механические манипуляции к минимуму, чтобы не ставить под угрозу качество окончательных изображений клеток. Всегда осторожно обращайтесь с клетками и покровными стеклами, никогда не допускайте их высыхания и избегайте попадания растворов непосредственно на клетки.

ФИКСАЦИЯ

  1. Аспирируйте культуральную среду из чашки или удалите каждое покровное стекло при необходимости с помощью пинцета и осторожно промойте их PBS при комнатной температуре.
  2. Инкубируйте покровные стекла в свежеприготовленном 4% параформальдегиде – нейтральном PBS при комнатной температуре в течение 10 минут. В качестве альтернативы клетки можно фиксировать в течение 10 минут в охлажденном метаноле (предварительно уравновешенном при -20°С) на льду.
  3. Совет: можно протестировать и сравнить альтернативные методы фиксации, чтобы определить, какой из них лучше всего сохраняет структуру и эпитоп интересующего белка.

  4. Вымойте покровные фиксатора в PBS в течение 2 минут.

ПРОНИЦАЕМОСТЬ

  1. Инкубируйте покровные в 0,5% Triton X-100 в PBS при комнатной температуре в течение пяти минут. Испытайте различные детергенты (например, дигитонин, твин-20) в различных концентрациях, чтобы найти оптимальные условия, которые лучше всего сохраняют клеточную структуру и целевой белок.
  2. Совет. При фиксации метанолом этап пермеабилизации не требуется, поскольку метанол действует как фиксатор, а также агент пермеабилизации клеток.

  3. Вымойте покровные буфера permeablization путем инкубации в PBS в течение 5 минут.

БЛОКИРОВКА

  1. IgG вторичного антитела могут неспецифически связываться с липкими участками клеток, что часто приводит к неспецифическому фоновому сигналу. Чтобы избежать этой проблемы, заблокируйте покровные стекла в 1-5% нормальной сыворотке, приготовленной в PBS, в течение одного часа при комнатной температуре.
  2. Совет: Нормальный блок сыворотки должен относиться к тому же виду, у которого выработалось вторичное антитело. Например, если вы используете вторичное антитело козы против кролика, заблокируйте его 5% нормальной козьей сывороткой.

  3. Альтернативными блокирующими агентами являются 1% желатин или 1-5% BSA в PBS.

МУЛЬТИКОЛОР ИММУНООКРАШИВАЮЩИЙ

Эксперименты по многоцветному мечению лучше всего проводить путем последовательной инкубации клеток с первичными и вторичными антителами, однако это можно выполнить, используя один из следующих трех вариантов:

Вариант № 1: последовательные инкубации с немечеными антителами
Этот метод полезен, когда задействованы первичные антитела от разных хозяев (например, мышиные моноклональные против антигена-X, кроличьи поликлональные против антигена Y и овечьи поликлональные против антигена Z), и антитела проявляют образование агрегатов в методе одновременной инкубации.

  1. Шаг блокировки № 1: инкубируйте клетки с блокирующим буферным раствором № 1 в течение 30 минут при комнатной температуре. Этот буферный раствор содержит 5% сыворотки того же вида, что и хозяин меченого вторичного антитела №1 (против первичного антитела №1).
  2. Первичная инкубация №1: инкубируйте клетки с первичным антителом №1 в 1% БСА или 1% сыворотке во влажной камере в течение часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С.
  3. Декантируйте раствор антител и трижды промывайте клетки в PBS-T (по 5 минут на каждую промывку).
  4. Вторичная инкубация № 1. Инкубируйте клетки со вторичным антителом № 1 в 1% БСА в течение одного часа при комнатной температуре в темноте.
  5. Декантируйте раствор антител и трижды промывайте клетки в PBS-T (по 5 минут на каждую промывку).
  6. Совет: Немедленно обработайте клетки для следующего шага и не позволяйте клеткам высыхать на любом этапе.

  7. Шаг блокировки № 2: инкубируйте клетки с блокирующим буфером № 2 (5% сыворотки вида, который совпадает с хозяином вторичного антитела № 2) в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
  8. Первичная инкубация № 2: Инкубируйте клетки с первичным антителом № 2 в 1% BSA или 1% сыворотке во влажной камере в темноте в течение одного часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.
  9. Декантируйте раствор антител и трижды промывайте клетки в PBS-T (по 5 минут на каждую промывку).
  10. Вторичная инкубация № 2: Инкубируйте клетки со вторичным антителом № 2 в 1% BSA в течение одного часа при комнатной температуре в темноте.
  11. Декантируйте раствор вторичного антитела и трижды промывайте PBS по пять минут каждый раз в темноте.
  12. Совет: повторите шаги 1–5 для дополнительных первичных антител. Во время различных этапов промывки обращайтесь с клетками очень осторожно, чтобы свести к минимуму возможные артефакты.

Вариант № 2: одновременная инкубация с немечеными первичными антителами
Этот метод полезен, когда первичные антитела получены от разных хозяев. Например, мышиное моноклональное антитело против антигена-X и кроличье поликлональное антитело против антигена Y.

  1. После стадии блокирования инкубируйте клетки с немечеными первичными антителами в блокирующем буфере во влажной камере в течение одного часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.
  2. Совет. Блокирующий буфер можно приготовить путем смешивания сыворотки от каждого хозяина вторичных антител. В качестве альтернативы в качестве блокирующего буфера можно использовать 5% BSA в PBS-T.

  3. Декантируйте раствор антител и трижды промывайте клетки в PBS-T (по 5 минут на каждую промывку).
  4. Инкубируйте клетки с обоими вторичными антителами в 1% BSA в течение одного часа при комнатной температуре в темноте.
  5. Совет: Вторичные антитела часто поставляются с широким диапазоном рабочих разведений. Рекомендуется очень тщательно выбирать разведения и использовать дополнительную оптимизацию, чтобы увидеть, какая комбинация разбавлений дает наилучшее возможное окрашивание.

  6. Декантируйте раствор вторичного антитела и трижды промывайте PBS по пять минут каждый раз в темноте.
  7. Совет: для более чистого окрашивания могут потребоваться дополнительные промывки.

Вариант № 3: одновременная инкубация с непосредственно мечеными первичными антителами
Этот метод полезен, когда первичные антитела получены от одного и того же хозяина. Например, мышь, моноклональная против антигена-X, и мышь, моноклональная против антигена-Y.

  1. После этапа блокировки инкубируйте клетки с непосредственно мечеными первичными антителами в блокирующем буфере во влажной камере в течение одного часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C в темноте.
  2. Совет. Использование флуоресцентно меченного фаллодина является хорошей альтернативой иммуноокрашиванию актина в качестве эталонного маркера при ИКК.

  3. Декантируйте раствор антител и трижды промывайте клетки в PBS-T (по пять минут на каждую промывку).
  4. Совет: может потребоваться дополнительная оптимизация для определения рабочего количества и времени промывок.

Контрастное окрашивание, монтаж и визуализация

  1. Когда все необходимые этапы промывки завершены, ядра клеток можно докрасить DAPI или Hoechst (1–10 мкг/мл).
  2. Переверните покровное стекло на предметное стекло с каплей монтажной среды, содержащей флуоресцентное вещество, препятствующее выцветанию.
  3. Совет: Если покровное стекло с ячейками случайно упало и ориентация «клетка вверх» утрачена, вы все равно можете спасти эксперимент, осторожно подняв покровное стекло пинцетом. Кроме того, аккуратно соскоблив одну поверхность покровного стекла кончиком пипетки, можно увидеть, удалены ли какие-либо клетки.

  4. Осторожно удалите излишки монтажного материала, если это необходимо, и при необходимости закрепите лаком для ногтей.
  5. Совет. В некоторые растворы для заливки уже добавлен DAPI, который затвердевает после контакта с воздухом, что устраняет необходимость герметизации краев покровного стекла.

  6. Изучите клетки под флуоресцентным микроскопом и изображением по мере необходимости.
  7. Совет: Избегайте длительного воздействия длины волны возбуждения флуорохрома, чтобы предотвратить фотообесцвечивание. Предметные стекла можно хранить в темноте при температуре -20°C или +4°C для повторного исследования.

СОВЕТЫ ПОСЛЕ АНАЛИЗА

Если в ваших образцах присутствует слишком много фоновой флуоресценции, попробуйте выполнить следующие рекомендации:

  1. Увеличьте процент блокирующих агентов, используемых на этапе блокировки, а также в первичных и вторичных буферах для разведения антител. Увеличьте время блокировки и/или уменьшите время инкубации антител.
  2. Разбавьте количество первичных и/или вторичных антител.
  3. Попробуйте погасить фиксирующий агент, чтобы устранить любые свободные альдегидные группы, которые могут неспецифически связывать антитела. Погасите формальдегид 0,1 М трис- или глициновым буфером и погасите глутаровый альдегид 0,1% боргидридом натрия.

Плюсы и минусы различных методов многоцветного окрашивания

Последовательные инкубации с немечеными антителами (непрямая детекция)

Одновременная инкубация с немечеными первичными антителами (непрямая детекция)

Одновременная инкубация с непосредственно мечеными первичными антителами (прямая детекция)

Чувствительность Этот метод более чувствителен, поскольку несколько вторичных антител могут связываться с одним первичным антителом. Этот метод является чувствительным, но перекрестная реакция вторичных узлов на другие узлы может быть проблемой. Этот метод менее чувствителен, поскольку теряется усиление сигнала, обеспечиваемое вторичным антителом.
Время анализа Этот метод требует больше всего времени из-за дополнительных инкубаций антител и стадий промывки (связанных с каждой мишенью). Этот метод требует меньше времени, поскольку первичные и вторичные антитела инкубируются одновременно. Этот метод занимает меньше времени, поскольку исключает этапы инкубации и промывки, связанные со вторичными антителами.
Мультиплексирование Мультиплексирование с использованием последовательных инкубаций с немечеными антителами относительно менее сложно. Этот метод часто сложен, так как перекрестная реактивность вторичных антител может привести к неспецифическому сигналу. Этот метод предлагает самый простой вариант мультиплексирования, поскольку можно использовать вместе много первичных антител одного и того же вида-хозяина.
Специфика Этот метод дает наиболее чистое окрашивание. Дополнительные этапы промывки (связанные с последовательными инкубациями) устраняют неспецифический сигнал. В этом методе неспецифический фон может быть серьезной проблемой, поскольку перекрестно-реактивные вторичные антитела могут связываться с более чем одной первичной мишенью. В этом методе неспецифический фон обычно низок, поскольку исключается вторичная перекрестная реактивность антител.
Гибкость Этот метод предлагает наибольшую гибкость. Помимо меченых вторичных антител, он дает возможность использовать вторые первичные антитела в качестве дополнительного уровня выбора при обнаружении.

Leave a Reply

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

You may use these HTML tags and attributes:

<a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

© 2022 economri.ru - All rights reserved